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N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc），化学式为C8H15NO6，是一种重要的多功能单糖，在生物体内作为多糖透明质酸、肝素、硫酸角质素的重要组成部分之一，维持生物体正常的生理功能。在生物医药领域，GlcNAc治疗风湿性关节炎具有显著功效；而在食品行业中，它不仅能用于食品抗氧化剂及婴儿食品添加剂，还是糖尿病患者的甜味剂及膳食补充剂等，具有保护骨关节及软骨组织的作用。GlcNAc在食品等行业的多功能性使其年需求量激增，在市场上具有广阔的应用前景。
合肥工业大学食品与生物工程学院的吴 昊、刘嘉荔、张洪斌*等人建立一种双酶协同催化体系，由ChiA和β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N组成。在最适反应条件下，该双酶协同催化体系可以实现一步反应高效降解胶体几丁质制备GlcNAc，具有反应条件温和、效率高、产物单一、副产物少等优点。旨在为酶法制备乙酰氨基葡萄糖的工业应用提供一种有效策略。
1、双酶协同降解胶体几丁质催化体系的建立
按上文方法对ChiA和HJ5N单独或协同催化胶体几丁质的产物进行HPLC分析，结果如图1所示。
排除9～10 min为K2HPO4/KH2PO4缓冲液的吸收峰，图1A在第13分钟左右出现了单一吸收峰，为ChiA水解后的产物几丁二糖(GlcNAc)2。图1B证明HJ5N不会对胶体几丁质产生水解作用，在液相谱图中未发现有明显的吸收峰。而从ChiA和HJ5N协同催化胶体几丁质（图1C）结果可以发现，第13分钟的几丁二糖吸收峰消失，在第15分钟左右出现了新的产物峰，经过与标准品（图1D）对比可初步确定为GlcNAc；通过质谱检测进一步鉴定该产物（图2），经分析可以确认M=GlcNAc，分子质量为221。质谱中主要产生m/z=261=221＋39＋1，为[M＋K＋H]＋（反应体系为磷酸钾缓冲液，K为39），结合HPLC检测结果可以确定双酶协同降解胶体几丁质的终产物为GlcNAc。这一结果证明了ChiA和HJ5N在对胶体几丁质的水解过程中存在协同作用，ChiA将胶体几丁质催化降解为几丁二糖(GlcNAc)2，再由HJ5N进一步降解成GlcNAc（图3）。
2、双酶协同反应机制
01
双酶协同反应机制分析
由图4可知，在相同反应条件下，ChiA单独催化仅有30%底物在6 h内被降解，6 h后底物几乎不会继续下降，而ChiA和HJ5N协同催化12 h可以持续降解60%的胶体几丁质，双酶协同催化降解胶体几丁质的效果远高于ChiA单独降解的效果。为了验证ChiA是否变性失活，反应6 h在ChiA单独催化的反应液中添加HJ5N，结果发现底物胶体几丁质可以继续被降解。
02
双酶协同催化的产物分析
通过对双酶协同催化反应不同反应时间的产物进行HPLC分析检测，验证产物抑制作用是否被消除。从图5可以看出，整个催化过程中，并无ChiA的降解产物(GlcNAc) 2 产生，只有GlcNAc在持续增加，直至反应平衡。这证明了ChiA和HJ5N的协同催化不仅可以完全消除ChiA的产物抑制作用，加强对胶体几丁质的降解，更可以实现一步反应制备GlcNAc无中间副产物生成。
3、不同因素对双酶协同催化体系的影响
01
温度对双酶协同催化体系的影响
如图6所示，HJ5N活力受温度影响较大，当温度在40 ℃以上时，HJ5N稳定性较差，随反应时间延长，HJ5N活力会持续下降直至失活，导致后续反应过程中只有ChiA在单独催化降解胶体几丁质，即(GlcNAc)2的质量浓度比GlcNAc高。而当温度低于40℃时，HJ5N较为稳定，能与ChiA协同催化发挥作用，将胶体几丁质持续水解为GlcNAc，反应液中也无(GlcNAc)2生成。因此双酶协同催化体系的最适反应温度为30 ℃。
02
pH值对双酶协同催化体系的影响
如图7所示，当pH值为6时，双酶协同催化反应的GlcNAc质量浓度最高，当pH值小于5时，反应液中只有少量GlcNAc存在，说明此pH值下的ChiA、HJ5N很快变性失活。而当pH值大于6时，GlcNAc质量浓度也只有pH 6时的一半左右，证明了双酶协同催化体系的最适反应pH值为6，此时ChiA和HJ5N可以发挥出最大的活性。
03
其余因素对双酶协同催化体系的影响
如图8A所示，当以40 g/L虾壳几丁质（胶体几丁质11.4 g/L）为底物时，产物GlcNAc质量浓度为9.11 g/L，收率达80%。当虾壳几丁质浓度上升到90 g/L（胶体几丁质30.3 g/L）时，GlcNAc质量浓度为17.55 g/L，收率为58%。继续增加虾壳几丁质浓度到100 g/L（胶体几丁质35.8 g/L），GlcNAc质量浓度反而下降到16.45 g/L，收率下降至46%。
由图8B可以看出，在固定ChiA添加量为30 U/mL的情况下，改变ChiA与HJ5N添加比对整个反应的影响较小，最终的GlcNAc质量浓度基本一致。因此按ChiA与HJ5N添加比为2∶1即保证双酶协同催化体系对胶体几丁质的降解效果。
04
双酶分步催化与协同催化效率对比
如图9所示。结果表明，在不同底物质量浓度下，当ChiA与HJ5N分步催化时，由于产物抑制作用的存在，GlcNAc质量浓度较低，且增长缓慢。而当ChiA与HJ5N协同催化时，GlcNAc质量浓度会随着底物质量浓度上升而增加，且远高于分步催化的结果，证明了双酶协同催化体系的有效性。
结果表明
双酶协同催化体系的最适反应温度为30 ℃，最适反应pH值为6，ChiA与HJ5N添加比（加酶量（U）计）为2∶1。在最优反应条件下以90 g/L虾壳几丁质（胶体几丁质30.3 g/L）为底物时，GlcNAc产量为17.55 mg/mL，收率达到58%。ChiA与HJ5N的协同作用机制主要表现在HJ5N可保证中间产物几丁二糖(GlcNAc)2快速被转化为GlcNAc，有效解除(GlcNAc)2对ChiA的抑制作用，从而实现双酶协同高效催化降解胶体几丁质制备GlcNAc。这为酶法降解胶体几丁质制备GlcNAc的工业应用提供了一种有效策略。
本文《双酶协同降解胶体几丁质及其作用机制》来源于《食品科学》2022年43卷6期74-80页，作者：吴昊，刘嘉荔，杨静文，胡雪芹，张洪斌。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210205-106。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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