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单宁酶（EC3.1.1.20）是单宁生物降解中最主要的一类酶，又被称为单宁酰基水解酶，可水解单宁底物，产生没食子酸和葡萄糖以及对应的醇等产物。单宁酶能降低高单宁食物在储存过程中形成浑浊、沉淀和令人感到不悦的味道，如茶饮料的“冷浑浊”果汁的“脱涩”等，单宁酶在食品行业中具有巨大应用潜力。然而，单宁酶制剂制备加工技术难度较高，限制了该酶的进一步应用。
随着生物技术的发展，工程菌株的出现为单宁酶的高效制备提供了一条捷径。河北农业大学食品科技学院的王玉印、卢海强、谷新晰*等利用惰性材料聚氨酯海绵为固态基质，对重组单宁酶工程菌株GS115-AfTan2.0进行固态发酵，并且与液态发酵相比较，分析毕赤酵母工程菌株固态发酵和液态发酵的优缺点，旨在为绿色高效制备单宁酶提供一定的技术指导，也为重组菌株的固态发酵提供一定的理论支撑。
1、固、液态发酵对重组菌生长规律的影响
测定固态发酵和液态发酵不同生长时间的细胞干质量，使用Prism 8.0拟合出固态发酵和液态发酵的毕赤酵母重组菌的Logistic生长曲线。如图1所示，相比于液态发酵的生物量，固态发酵的生物量提高了约22.3%。
2、固态发酵和液态发酵毕赤酵母细胞聚集性差异的分析
如图2所示，液态发酵培养48 h，毕赤酵母细胞分布相对分散，形成较小的毕赤酵母细胞聚集体；培养96 h，观察毕赤酵母细胞聚集体有所增大。固态发酵培养48 h，毕赤酵母细胞在聚氨酯海绵较为平坦的结构上相对分散，但形成了簇状细胞聚集体，而在聚氨酯海绵凹陷的结构上形成了体积较大细胞聚集体或生物膜；培养96 h，观察到聚氨酯海绵上细胞簇状聚集体和生物膜进一步增大和增厚。
3、固、液态发酵对重组菌产酶量的影响
如图3所示，两种发酵方式诱导期间细胞干质量均无明显变化，其原因为BMGY培养基中的甘油会抑制毕赤酵母中AOX1启动子，当培养48 h后，甘油几乎消耗殆尽，此时加入甲醇，AOX1失去了甘油的抑制后开始启动，对目的基因进行表达，此时的酵母细胞更多的能量用来表达蛋白而不是自身的生长繁殖。所以诱导期间固液两种发酵方式的重组菌细胞干质量均无明显变化。液态发酵在诱导144 h发酵上清液单宁酶活力达到最大值8.93 U/mL，此时发酵上清液的总蛋白质量浓度为0.59 g/L（图3A）。固态发酵的发酵上清液单宁酶活力同样在诱导144 h达到最大值2.43 U/mL，其总蛋白质量浓度为0.26 g/L（图3B）。
4、甲醇体积分数对重组菌固、液发酵产酶量的影响
由表1可知，随着诱导剂甲醇添加量的升高，诱导出的酶活力也在提高，其中液态发酵过程在甲醇添加量为3%时酶活力达到最大值，在48 h和72 h分别达到了3.34 U/mL和5.30 U/mL；但是固态发酵过程中毕赤酵母在甲醇添加量为2%时有最高酶活力，分别为0.72、1.86 U/mL和2.23 U/mL。一般认为甲醇是大多数巴斯德毕赤酵母发酵策略中的主要碳源和基因表达诱导剂，但高浓度甲醇对细胞有毒性，会导致甲醛和过氧化氢的积累，从而导致细胞死亡。
5、SDS-PAGE分析
结果如图4所示。两者均产生了80 kDa的蛋白，但固态发酵液中在50 kDa分子质量处也出现了蛋白条带。由上述结果推测，固态发酵使得单宁酶产生了更多的修饰，而这很可能是造成酶性质发生改变的原因。
6、固态发酵和液态发酵单宁酶酶学性质差异分析
结果如图5所示。由图5A可知，固态发酵所产的单宁酶最适温度为30 ℃，液态发酵所产的单宁酶最适温度为20 ℃，固态发酵的方式使单宁酶的最适温度提高了10 ℃。由图5B可知，固态发酵和液态发酵所产的单宁酶的最适pH值均为6.0。由图5C可知，在50 ℃的处理条件下，两发酵方式所产的单宁酶残余酶活力无差异，而在60 ℃的处理条件下，两发酵方式所产的单宁酶残余酶活力下降趋势相同，但液态发酵所产单宁酶的热稳定性略优于固态发酵所产的单宁酶。由图5D可知，两发酵方式所产的单宁酶残余酶活力下降趋势相同，整体看，在pH 4～11的范围内液态发酵所产单宁酶的pH值稳定性略优于固态发酵。
结 论
对毕赤酵母工程菌分别进行固态发酵和液态发酵，分别比较了生物量、产酶量、所产酶蛋白分子质量和酶性质的差异。固态发酵得到了较高生物量却没有得到较高酶活力，并且由于固态发酵条件下蛋白被过度修饰导致了其所产酶的最适温度升高。后续可以开展实验对固态发酵的工艺条件进行探究，对固态发酵蛋白分子改变的原因进行深入挖掘，这对模式菌株的固态发酵以及酶的高效生产都有积极意义。
本文《毕赤酵母单宁酶工程菌在固、液发酵中的性质差异分析》来源于《食品科学》2022年43卷14期118-124页，作者：王玉印，卢海强，陈伟，张莉娟，田洪涛，谷新晰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210810-135。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于 2022年12月3-4日 在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。
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