中国医科大学考研招生简章，中国医科大学考研招生简章2023
导读
薏苡附子败酱方（YFB）是一种由薏苡仁、附子和败酱草组成的中药方剂，几千年来一直用于治疗溃疡性结肠炎（UC）。本研究旨在探究YFB配方对2，4，6-三硝基-苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠UC的治疗效果和代谢分析。YFB配方中的六种主要生物碱通过UPLC–MS/MS测定。我们通过TNBS诱导大鼠UC模型，通过疾病活动指数（DAI）评分和苏木精-伊红（HE）染色评估YFB配方对UC的治疗效果。UPLC-QTRAP-MS代谢组学技术用于结合多变量数据统计筛选YFB治疗UC的潜在生物标志物，并进一步分析相关代谢途径。Western blotting检测大鼠肝组织中NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase1和Caspase-1的蛋白水平。我们采用ELISA和免疫组化方法检测大鼠血清和肝组织中白细胞介素（IL）-17A、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量。结果发现，YFB组的DAI评分显著降低，结肠组织损伤显著改善（p < 0.01)。代谢组学分析显示血清中有29个潜在生物标志物，肝脏中有27个潜在生物标志物。YFB配方可通过影响甘油磷脂代谢、初级胆汁酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢来治疗UC。与模型组相比，YFB组IL-17A、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量呈剂量依赖性降低（p < 0.01)。与模型组相比，YFB组NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase1和Caspase-1的蛋白水平以剂量依赖的方式显著降低（p < 0.01)，表明YFB配方对UC大鼠的治疗作用是剂量依赖性的，YFB组(2.046 g/kg)的效果接近阳性药物组。因此，我们发现YFB配方通过调节大鼠Th17/Treg细胞的平衡对UC具有抗炎作用。
亮点：
1. 首次进行代谢组学分析YFB治疗UC的机制；
2. YFB可调节UC大鼠Th17/Treg细胞的平衡；
3. YFB显著恢复UC大鼠的多种代谢产物；
4. YFB可能通过调节多种代谢途径来治疗UC。
论文ID
原名：Therapeutic effect of Yiyi Fuzi Baijiang formula on TNBS-induced ulcerative colitis via metabolism and Th17/Treg cell balance
译名：薏苡附子败酱方通过代谢及Th17/Treg细胞平衡治疗TNBS诱导的溃疡性结肠炎
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2023.02
通讯作者：岳冬梅，项峥
通讯作者单位：中国医科大学附属盛京医院，辽宁大学药学院
实验设计
实验结果
1. YFB方中生物碱的UPLC–MS分析
我们通过梯度洗脱15分钟获得最佳分辨率和峰形 ，以含0.1%甲酸（A）和乙腈（B）的水作为流动相。表1列出了每种分析物的前体-产物离子对、碎裂电压（Frag）和入射电压（CE）。在这些条件下，YFB方中六种生物碱的代表性MS/MS色谱图如图1所示，YFB型中六种碱的MRM色谱图如表S1所示。。
表1 YFB配方中六种生物碱的质谱参数
图1 YFB方中六种生物碱的代表性MS/MS色谱图
1:苯甲酰中乌头原碱，2:苯甲酰乌头原碱，3:苯甲酰次乌头碱，4:中乌头碱，5:次乌头碱，6:乌头碱。
2. 方法学验证
YFB配方中的六种生物碱通过线性、重复性、精密度（日内和日间）和回收率检验进行测定。所有成分的标准校准曲线如表2所示。结果表明，各被测物质在各自浓度范围内呈良好的线性关系（R2 ≥ 0.9990)。日内和日间精密度分别小于3.14%和3.67%。所有成分均具有良好的重复性，RSD<2.86%。所有成分的回收率在85.46%至110.24%之间。
表2 YFB配方中六种生物碱的校准曲线、R2和浓度范围
3. YFB方中生物碱的含量
我们使用建立的分析方法测定YFB配方中6种生物碱的含量，结果如表3所示。
表3 YFB配方中六种生物碱的含量（μg/g）
BMA：苯甲酰中乌头原碱，BCA：苯甲酰乌头原碱，BHA：苯甲酰次乌头碱，MA：中乌头碱，HA：次乌头碱，AC：乌头碱。
4. YFB方对UC的保护作用
建立大鼠UC模型后，我们观察大鼠体重和粪便形态，并记录DAI评分。结果显示，与正常组相比，模型组大鼠体重显著下降，DAI评分显著升高。YFB组大鼠的体重减轻以剂量依赖的方式得到改善，DAI评分与阳性药物组相似（图2A和B）。
图2 YFB方对UC大鼠临床症状的影响
（A）UC大鼠14天体重变化。（B）疾病活动指数（DAI）得分。**与模型组相比，P<0.01，***P<0.001。
结肠长度通常用于评估溃疡性结肠炎的程度。实验结果显示，模型组大鼠的结肠长度缩短，与模型组相比，阳性药物组和YFB组大鼠的结肠长度增加（P < 0.05）（图3A和B）。
图3 YFB方对UC大鼠结肠缩短的影响
（A）每组代表性结肠组织。a：正常组，b：模型组，c:YFB（0.682 g/kg），d:YFB（1.364 g/kg），e:YFB（2.046 g/kg），f：阳性药物组。（B）结肠长度。**与模型组相比，P<0.01，***P<0.001。
5. 病理学分析
在模型组的病理图片中，大部分杯状细胞和隐窝结构消失，粘膜完整性受损，大量炎性细胞浸润。阳性药物组结肠组织结构部分紊乱，部分腺体被破坏，并观察到少量炎性细胞。在YFB组中，结肠组织水肿轻微，只有少量腺体被破坏，出现较少的炎性细胞，与模型组相比显著改善（图4）。
图4结肠组织HE染色（400 × )
A：正常组，B：模型组，C：阳性药物组，D：YFB（0.682 g/kg）组，E:YFB（1.364 g/kg）组，F:YFB（2.046 g/kg）组。炎症细胞浸润（黑色→)，杯状细胞（红色→)。
6. 代谢分析
我们进一步分析血清和肝脏代谢产物的变化。与模型组相比，给药后血清中37种代谢产物显著改变（FDR<0.05）（图5）。模型组肝组织中36种代谢产物含量与正常组相比有显著变化（FDR＜0.05），其中27种代谢产物在给药后显著改变（FDR<0.05）（图6）。具有FDR（调整后的p值） < 0.05的代谢物出现在表S1和S2中。
图5 YFB方对UC大鼠血清代谢产物的影响
Normal：正常组，Model：模型组，YFB:YFB（2.046 g/kg）组。*表示与正常组的比较，*FDR＜0.05，**FDR＜0.01；#表示与模型组的比较，#FDR<0.05，##FDR<0.01（使用Benjamini Hochberg对多次检验比较进行了Mann-Whitney U检验修正）。
图6 YFB方对UC大鼠肝脏代谢产物的影响
Normal：正常组，Model：模型组，YFB:YFB（2.046 g/kg）组。*表示与正常组的比较，*FDR＜0.05，**FDR＜0.01；#表示与模型组的比较，#FDR<0.05，#FDR<0.01（使用Benjamini Hochberg对多次检验比较进行了Mann-Whitney U检验修正）。
7. 血清代谢分析
本实验分析了正常组、模型组和YFB(2.046 g/kg)组血清代谢产物的差异。PLS-DA分析(图S2A)显示正常组、模型组、YFB组样品分布区域不同，可完全分离，而同一组中的样本趋于聚集。结果表明，三组之间的代谢组存在差异。我们设定的指标合理有效，可用于UC药物干预的体内评价。P检验分析表明，不同组之间的分离模型没有过度拟合（图S2B）。
为了进一步探讨YFB是否对UC有治疗作用，我们对所有组进行了OPLS-DA分析（图S3）。结果表明，正常组、模型组和YFB组可以最大程度地分离，有效地减少了组内的个体差异。VIP值越大，各组之间差异的贡献越大（表S3和S4）。
根据构建的PLS-DA模型的变量投影重要性（VIP），我们筛选满足VIP>1和P < 0.05的代谢物。与正常组相比，给药后我们观察到血清中29种关键代谢产物和各种指标的变化（表S5）。
8. 肝脏代谢分析
PLS-DA分析(图S4A)显示YFB组与模型组分离明显，无交叉，各组内样品聚集，表明YFB方可引起UC大鼠代谢网络的显著变化。P检验分析表明，各组之间的分离模型没有过度拟合（图S4B）。
OPLS-DA用于进一步分析数据。结果表明，正常组和模型组以及正常组和YFB组完全分离。每个散点代表一个样本，散点的形状和颜色代表不同的实验组。样品之间的水平距离越远，组之间的差异越大，纵向距离越近，组内的重复性越好（图S5）。VIP值按降序列出（表S6和S7）。
与正常组相比，给药后我们观察到肝脏中27种关键代谢产物和指标出现变化（VIP>1，P < 0.05）（表S8）。为了进一步了解不同组之间的代谢差异，我们通过Metaboanalyst网站可视化血清和肝脏代谢数据，并生成聚类热图（图7，图8）。
图7大鼠血清中生物代谢产物的热图
血浆YN：正常组，血浆YM：模型组；血浆Y:YFB（2.046 g/kg）组。
图8大鼠肝脏生物代谢产物热图
YN：正常组，YM：模型组；Y：YFB（2.046 g/kg）组。
9. 代谢分析
为了研究YFB方的相关生物标志物在UC大鼠治疗中所涉及的代谢途径和代谢产物之间的相关性，我们将所有差异代谢产物导入Metaboanalyst 5.0在线分析平台，以找到它们的相关性，并筛选出在UC治疗中与YFB方最相关的代谢途径从而进行代谢途径分析（图S6、S7、S8和S9）。
代谢途径分析揭示了与UC相关的重要代谢途径：初级胆汁酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油磷脂代谢等。TFB方主要影响了初级胆汁酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）、乙醛酸和二羧酸代谢、脂肪酸生物合成等代谢途径。
10. ELISA分析
与正常组相比，模型组结肠组织和血清中IL-17A、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的水平明显升高（P < 0.01)。与模型组相比，阳性药物组和YFB组结肠组织和血清中IL-17A、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的水平降低，如图9所示。
图9大鼠结肠组织和血清中细胞因子的ELISA分析
（A）结肠。（B）血清。#与正常组相比，P<0.05、P<0.01；*与模型组相比，P<0.05，**P<0.01。
11. 免疫组化染色分析
与正常组相比，模型组NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase1和caspase-1蛋白的平均光密度显著增加。与模型组相比，YFB组和阳性药物组NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase1和caspase-1蛋白的平均光密度值均有不同程度的降低，差异有统计学意义（P< 0.01，P < 0. 05)，如图10、图11所示。
图10各组大鼠结肠蛋白免疫组化结果
图11各组大鼠结肠组织中NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase1和Caspase-1蛋白的平均光密度值直方图
#与正常组相比，P<0.05、P<0.01；*与模型组相比，P<0.05，**P<0.01。
12. 免疫印迹分析
Western blot结果显示，模型组大鼠结肠组织中NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase-1和caspase-1的蛋白表达水平显著高于正常组（P < 0.01)。给药后大鼠组织中NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase1和caspase-1的蛋白质含量以剂量依赖性方式降低（P< 0.01）（图12）。
图12 NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase 1和Caspase-1在大鼠结肠中的表达
（1，正常组；2，模型组；3，阳性组；4，YFB（0.682 g/kg）组；5，YFB（1.364g/kg）组；6，YFB（2.046g/kg）组）。#与正常组相比，P<0.05、P<0.01；*与模型组相比，P<0.05，**P<0.01。
UC在中医上被归类为“intestinal fetish”和“慢性痢疾”，但其发病机制尚不清楚。目前，UC的临床治疗主要使用5-氨基水杨酸盐、类固醇和免疫抑制剂，但存在一些不足，如维持治疗效果不佳、长期使用肝肾损伤等不良反应，以及患者的沉重经济负担。YFB方具有温阳健脾、清热利湿、解毒的作用。现代药理研究证实，它可以改善TNBS诱导的大鼠UC。本研究通过对多种代谢产物进行UPLC–MS/MS分析，在血清和结肠组织样本中检测到29种和28种不同的代谢产物，涉及嘌呤代谢、丙酮酸代谢、初级胆汁酸生物合成、甘油磷脂代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和其他代谢途径。在给予YFB方后，大鼠血清和结肠组织中的差异代谢产物水平总体上呈现出向正常水平变化的趋势，影响了甘油磷脂代谢、初级胆汁酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、脂肪酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢途径。
研究表明，UC患者的结肠组织中存在异常的氨基酸代谢。氨基酸代谢直接参与体内代谢。UC患者有肠道损伤和代谢失衡。在这项研究中，各种氨基酸代谢途径的水平发生了变化，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径的差异最为显著。这一途径可以产生 乙酰辅酶 A，乙酰辅酶A是三羧酸（TCA）循环的代谢前体，可以为身体提供能量。与正常组相比，模型组的甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径和能量代谢水平升高。给药后甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径的水平发生逆转，表明YFB方对甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢通路具有调节作用。
溶血磷脂酰胆碱（LPC）是一种与炎症密切相关的生物代谢产物，在炎症病变的发生和发展中起着重要作用。高浓度的LPC会损害肠粘膜屏障的功能并增加胃肠道的通透性。在本研究中，模型组的多种LPC代谢水平发生异常变化，表明大鼠的炎症反应存在异常变化，而在给予YFB方后，大鼠的LPC代谢水平趋于正常。这表明YFB方可能通过影响LPC代谢和调节异常炎症反应在UC治疗中发挥作用。
胆汁酸与UC密切相关。UC可以改变体内主要胆汁酸的水平。肠道菌群在胆汁酸代谢中起着重要作用，参与了去黏附、氧化、差异异构化、7α-脱氢、酯化和脱硫。UC的肠道受损，肠道菌群失调，导致胆汁酸代谢受到影响，胆汁酸含量增加。服用YFB方后，胆汁酸含量恢复，表明YFB配方可以通过影响初级胆汁酸的代谢来治疗UC。
研究证明Treg和Th17 细胞也参与UC的病理过程。Treg细胞在T淋巴细胞的活化和增殖中起着负调节作用。通过抑制或释放抗炎细胞因子如TGF-β和IL-10，我们可以调控免疫反应的强度，保持免疫耐受，控制胃肠道炎症的程度。功能异常或Treg细胞数量减少可导致肠粘膜损伤。Th17 细胞作用于肠道内皮细胞的IL-17受体，上调下游炎症因子，释放多种促炎因子，如IL-21、IL-22、TNF-α等，参与肠道炎症反应。
这项研究的结果表明，UC导致胆汁酸的肠肝循环中断，并导致血液和肝组织中总胆汁酸的累积。胆汁酸代谢产物可以调节Th17和Treg细胞的分化。胆甾醇酸（LCA）的两种不同衍生物，即3-OxoLCA和isoalloLCA，被用作小鼠的T细胞调节剂。3-OxoLCA通过直接结合RORγt抑制TH17 细胞的分化，而isoalloLCA通过产生线粒体活性氧(mitoROS)增强Treg细胞的分化，这导致FOXP3表达的增加。在此基础上，我们进一步研究了结肠组织和血清中Th17/Treg细胞相关炎症因子如IL-17A、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的水平。结果表明，模型大鼠结肠组织和血清中IL-17A、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量显著升高。给药后，胆汁酸代谢正常，并通过调节Th17/Treg细胞的平衡发挥抗炎作用。
炎症小体作为一种免疫受体，在UC的发病机制中发挥着重要作用。目前，炎症小体有很多种，包括NLRP1炎症小体、NLRP3炎症小体、NLRC4炎症小体和AIM2炎症小体。其中，NLRP3炎症小体是研究最多的，它可以诱导IL-1β和IL-18的产生和释放，导致T细胞亚群紊乱，并加速肠道炎症的发生和发展。在感染、粘膜损伤和应激期间，促炎因子和趋化因子的表达上调。在本研究中，我们检测了结肠组织中NLRP1、NLRP3、NLRC4、ASC、pro-caspase-1和caspase-1的蛋白表达。结果表明，与模型组相比，YFB组炎症小体通路蛋白的表达显著降低，表明YFBP可能通过抑制炎症小体激活在治疗UC中发挥作用。
YFBP可有效调节脂质代谢、胆汁酸代谢、氨基酸代谢等代谢途径。YFBP使胆汁酸代谢恢复正常，同时炎症小体激活受到抑制，Th17/Treg相关炎症因子水平降低，减少了炎症反应和肠屏障损伤，从而在UC的治疗中发挥作用。
结论
在本研究中，我们测定了YFB方的生物碱含量，并探讨了YFB对TNBS/乙醇诱导的大鼠UC的作用机制。代谢组学分析表明，YFB方可能通过调节各种代谢途径（氨基酸代谢、胆汁酸代谢等）在UC治疗中发挥作用。蛋白质炎症因子的检测结果还表明，YFB方可能通过调节Th17/Treg细胞的平衡在治疗UC中发挥作用。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36842724/
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