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大豆作为世界上应用最多的豆类之一，与其他豆类相比，有价格低、营养价值高、来源广等优点。大豆异黄酮（SIF）是一种多酚类化合物，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，是从大豆中提取的一种活性物质。SIF具有抗氧化、抗肿瘤、维持动物正常生殖机能、预防甚至治疗骨质疏松症、更年期综合症、前列腺癌等功效。染料木素（Ge）是一种苷元型的SIF单体，可直接被人体消化吸收，具有植物雌激素的活性。大豆分离蛋白（SPI）是将豆粕粉中的可溶性及不可溶性碳水化合物、灰分等去除后得到的一种全价蛋白，其中蛋白质含量占90%以上。
吉林农业大学食品科学与工程学院的吕思瑶、朱登兆、谷春梅*等以SPI和Ge为研究对象，在碱性条件下制备SPI-Ge共价复合物，对其表征特性进行探究，并通过紫外吸收光谱、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱法3种光谱学方法研究蛋白的结构特性。这不仅能拓宽SPI食品的研发领域，还可以为SPI-Ge共价复合物在食品中的应用提供创新思路和一定理论依据。
1、SPI-Ge共价复合物的表征分析
SPI-Ge共价复合物的粒径变化
01.
如图1所示，粒径分布主要成单峰，表明所形成的溶液体系较稳定，其中对照组与实验组的中位径（D50值）基本都在90～160 μm之间，而且还可以看出SPI-Ge共价复合物的粒径分布范围相比于对照组都有所减小。其中对照组与实验组的D50值从大到小依次为SPI组（135.6 μm）＞SPI-Ge-2.0组（117.6 μm）＞SPI-Ge-1.5组（108.9 μm）＞SPI-Ge-1.2组（98.0 μm）。由此可以看出，与对照组相比，实验组的中位径显著减小（P＜0.05），并且随着Ge质量浓度的增加共价复合物粒径逐渐增大，其中SPI-Ge-1.2组的粒径最小，稳定性最强。
SPI-Ge共价复合物的Zeta电位变化
02.
如图2所示，对照组的Zeta电位绝对值最小，为15.0 mV；共价复合物溶液与对照组相比，Zeta电位的绝对值显著增大（P＜0.05），说明在碱性条件下Ge与SPI共价交联后能够使蛋白的Zeta电位绝对值增大，结构更加稳定。此外，从图2还可以看出，随着SIF质量浓度的增加共价复合物溶液的电位绝对值减小，低质量浓度组（SPI-Ge-1.2）的Zeta电位绝对值最大（21.4 mV），高质量浓度组（SPI-Ge-2.0）的Zeta电位绝对值最小（17.1 mV）。
SPI-Ge共价复合物的浊度的变化
03.
结果如图3所示。可以看出，对照组的浊度显著低于共价复合物组（P＜0.05），这是因为在碱性条件下多酚与蛋白发生共价交联会使酚类物质氧化成棕色的醌类物质，所以碱性条件形成的共价复合物的浊度大于对照组。此外，实验组中随着Ge质量浓度的增加，共价复合物溶液的浊度增加，说明在实验组中，SPI-Ge-1.2组更加稳定，这与粒径结果一致。
SPI-Ge共价复合物的表面疏水性的变化
04.
如图4所示，与对照组相比，共价复合物的表面疏水性显著降低（P＜0.05）。由此可以看出Ge与SPI共价交联后能够使SPI的表面疏水性减小，这可能是由于Ge与SPI的共价相互作用使蛋白结构发生改变，将内部的亲水区域暴露出来，复合物的表面疏水性降低，从而使SPI表面的疏水性向亲水的结构改变。从图4还可知，随着Ge质量浓度的增加，表面疏水性增加，当质量浓度为1.2 mg/mL时表面疏水性最小。
2、SPI-Ge共价复合物的结构变化
SPI-Ge共价复合物的总巯基的变化
01.
从图5可知，与对照组相比，SPI与Ge在碱性条件下共价交联后总巯基含量显著下降（P＜0.05）。一方面，这可能是由于与蛋白质发生共价作用时，Ge羟基基团与SPI巯基基团发生结合，从而使巯基含量减少；另一方面，当发生共价交联时，Ge的羟基能够氧化成醌，然后与SPI上的巯基发生交联形成巯基-醌的加成物，也使巯基含量减少。此外，从图5还发现，随着Ge质量浓度的增大，总巯基含量显著增加（P＜0.05），这可能是由于SPI与Ge过度交联，Ge与SPI共价作用减弱，导致总巯基含量随之增加。
SPI与Ge共价作用的紫外吸收光谱分析
02.
从图6可以看出，对照组与实验组均在波长290 nm左右处出现峰值，并且在加入Ge后，共价复合物的峰值明显升高。与此同时，与对照组相比，实验组SPI-Ge-1.2的吸收峰波长由290 nm蓝移到285 nm。共价复合物的吸光度升高可能是因为SPI与Ge的共价交联导致蛋白质发生解折叠，色氨酸与酪氨酸残基暴露，微环境的疏水性降低，蛋白质解折叠使更多的发色基团转移到蛋白质的表面。
SPI与Ge共价作用对蛋白内源性荧光光谱的影响
03.
如图7所示，在发射光谱扫描范围波长300～500 nm、激发波长280 nm、温度25 ℃的条件下，蛋白质的最大发射波长为337 nm，并在303 nm左右未出现峰值，所以本实验主要探究色氨酸的变化。从图7可以看出，与对照组相比，加入Ge后SPI的荧光强度降低，随着Ge质量浓度的增加SPI的荧光强度逐渐升高，并且共价复合物的最大发射波长发生1 nm的红移，说明共价复合物的结构发生改变。
SPI与Ge共价作用的傅里叶变换红外光谱分析
04.
从图8可以看出，与对照组相比，加入Ge后，酰胺I带的峰值发生波数由1 643 cm-1至1 650 cm-1的蓝移，表明Ge与SPI发生了相互作用，并且形成的新的共价复合物改变了SPI的二级结构。
如表1所示。与对照组相比，加入Ge后的共价复合物中α-螺旋含量增多、β-折叠含量减少、β-转角含量增多、无规卷曲含量减少。此外，还发现随着Ge质量浓度的降低，蛋白质二级结构中α-螺旋含量增多、β-折叠含量减少、β-转角含量增多、无规卷曲含量减少。因此说明Ge与SPI共价交联会对SPI的二级结构造成影响，另外低质量浓度的Ge对蛋白质结构影响更加明显，Ge质量浓度过高时会对蛋白质的结构影响减弱。
结 论
将SPI与Ge在碱性（pH 9.0）条件下得到的共价复合物进行表征和结构分析，发现加入Ge后蛋白的粒径分别减小了37.6、26.7、18.0 μm，Zeta电位绝对值分别增大了6.4、3.8、2.1 mV，表面疏水性分别减小了100.5、87.5、80，总巯基含量分别减少11.1、8.3、5.8 μmol/g，这说明低质量浓度Ge的引入对蛋白质的影响更加明显。同时添加Ge后共价复合物的浊度都有着不同程度的增加，说明碱性条件下SPI与Ge发生了共价作用。在对SPI-Ge共价复合物的紫外吸收光谱与荧光光谱分析中，发现二者发生共价相互作用后使蛋白质的色氨酸与酪氨酸残基所处的微环境疏水性减少，并且Ge对SPI有猝灭的效果，低质量浓度Ge猝灭效果更好。红外光谱分析表明SPI与Ge形成共价复合物后蛋白的α-螺旋含量增多、β-折叠含量减少、β-转角含量增多、无规卷曲含量减少，导致了二级结构的相互转化。与对照组相比，Ge质量浓度越高，对蛋白质的二级结构作用效果越弱。
本文《大豆分离蛋白与染料木素共价交联对蛋白表征和结构的影响》来源于《食品科学》2022年43卷12期94-100页，作者：吕思瑶，朱登兆，鲍云翔，张德斌，于寒松，谷春梅。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210706-051。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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