流式管，流式管规格
记得还是前几年的时候流式结果的绝对计数统计还是个专属于临床流式的事情，在临床上比如HIV携带者的CD4绝对值统计是拿来评估患者的重要指标之一，而在科研流式领域进行绝对计数统计的老师寥寥无几，甚至于很多时候大家认为绝对计数统计是没啥意义的。
然而这几年科研流式圈对于绝对计数统计的重视已经越来越明显，已经不止一个老师抱怨说因为一开始没做流式的绝对计数而被审稿人要求重新统计数据或补实验了，今天就来和大家聊聊绝对计数在科研流式中的意义。
首先大家应该明确一个概念，就是流式细胞仪上自带的计数events并不是样本本身的真实数值，而是机器对收取的“颗粒数”的一个大致的统计，同一个样本，在不同仪器上的“颗粒数”是不一致的。
所以并不是我们收取了多少个events就是真的对应了多少个细胞，这里面包含了细胞，信噪比，碎片等一系列信号的集合而拟合出来的一个数值。
Flowjo数据统计时的Cells，流式上机时的EvT，均不是真实的绝对计数值：
那么一个流式数据在这个数值的参照下得到的结果有什么可比性呢？一般来说会比较两个东西，一个是某个通道的阳性百分比，一个是某个通道的平均荧光强度，这两者都是不需要绝对计数而可以直接获取的信息，所以在未进行绝对计数统计时。
我们得到的结果无外乎就是细胞亚群彼此之间的比例关系，以及细胞亚群的蛋白表达水平。
大部分实验中，上述两个信息量已经足够我们进行数据统计了，但是万事无绝对，对于一些微环境中的样本，我们除了统计上述的信息量，更要去做绝对计数的统计，才能发现一些样本之间的差异。
例如在某组织样本中，对照组相比治疗组的免疫细胞整体下降，这时我们如果单看免疫亚群的比例可能无法获得任何差异性，但是如果我们统计的是绝对计数值，则可以清晰的发现其具体差异是在大的免疫细胞总数上；
例：2个样本的CD3+的比值差异不大，但是细胞数差异巨大，单纯从比例圈门我们很难说明这种差异，而对其进行绝对计数值的差异比较则可以：
再例如我们在处理人的外周血样本时如果裂红的效果不一致，也会导致免疫亚群占all events的比例出现不一致，此时如果进行绝对计数值的统计则就不会出现这种不一致的现象了。
例：同一个病人的样本，裂红充分时CD3+为13.3%，不充分时为3.66%，如果用百分比统计就出现了误差，而如果用绝对计数值统计则会减少这种误差：
那么我们怎么对样本进行绝对计数值的统计呢？
方法有两个，第一，就是直接使用计数仪对每个待上机的样本进行绝对计数，当然这种方法需要有仪器的支撑，做起来会比较累人；另一种方法相对就简单很多，直接购买一些可以用于绝对计数的微球/微球管，使用他们来完成绝对计数的统计。
这里就以BD的绝对计数管为例，我们来看看是如何计算的：
首先，绝对计数管就是一种流式管，管中预先加有准确定量的Beads，我们使用这种流式管完成孵育样本的操作后，在流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，就可以计算出相对含量% ，然后由各目标群与Beads的相对量计算，就得到该细胞群的绝对含量了。
计算公式如下：
整个样本的制备流程其实也没啥难度，基本和普通染色是一致的：
最终我们在实验结果中gate出微球群的比例和待统计细胞的比例，就可以得到其绝对计数值了：
总的来说，绝对计数在科研流式的应用中已经变得越来越被重视，尤其是在一些组织微环境的免疫亚群检测统计中变得越来越常见，如果各位老师在今后涉及到类似的实验时一定要留个心，不要忽视其带来的统计学意义。
流式管(流式管规格)