武汉理工研究生，武汉理工研究生院
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原创丨百年孤寂（学研汇 技术中心）
编辑丨风云
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骨骼等生物杂化材料巧妙地将硬质无机纳米级矿物和软质有机基质组合成分层结构，以实现特定的特性和功能。这种复杂的结构贯穿到纳米宏观尺度，与它们的人工替代物相比，这种天然的生物矿化材料具有十分优越的机械性能。胶原蛋白是我们身体细胞外组织的主要成分，从肌腱、骨骼到皮肤和动脉壁都有分布。在骨骼中，胶原蛋白由碳酸羟基磷灰石的纳米级颗粒增强。另一方面，天然胶原基组织中的预应力对其整体机械性能有很大贡献。但是，当其在脱水或在较大渗透压下，骨胶原分子的长度会发生收缩，目前这种现象与矿物沉积的关系尚不明确。在骨形成过程中，胶原原纤维与碳化羟基磷灰石矿化，从而形成具有优异性能的杂化材料。其他矿物质也被认为在体外的胶原内成核。对于一系列的锶和钙基矿物，武汉理工大学傅正义院士团队观察到它们的沉淀导致胶原原纤维的收缩，达到几兆帕斯卡的压力。应力的大小取决于矿物的类型和数量。利用原位同步辐射x射线散射，分析了矿物沉积动力学。当矿物沉积在原纤维外时不发生收缩，原纤维内矿化产生原纤维收缩。这种化学机械效应发生在完全浸入水中的胶原蛋白，并产生矿物-胶原蛋白复合材料与拉伸纤维，让人联想到钢筋混凝土的原理。
原位X射线散射表征后收缩应力
图1. 碳酸锶晶体在胶原组织中沉积会产生兆帕级收缩应力。
研究者在SrCO3存在的情况下，通过原位X射线散射监测胶原基质的相应矿化过程和内应力的形成，首先使用配备反应室和光学显微镜系统的定制机械测试装置研究了SrCO3未矿化的火鸡腿的肌腱在矿化过程中产生的应力（图1A）。作为已知的能够在体内矿化的平行胶原纤维的生物来源，本文使用了未矿化的火鸡肌腱切片，并将它们浸入SrCO3前体相中。这些前体首先渗透到肌腱的胶原纤维中，然后作为成核部位，最终导致逐渐的矿物质沉积。矿化过程通过矿化前沿附近区域的拉曼扫描显微镜进行监测。根据碳酸盐群(1080 cm2)对称拉伸模式v1的线强度时空变化。5 h信号强度开始增强，20 min后信号强度增强。说明此时矿化锋已越过观测窗口。此外，SrCO3在1080 cm2处的特征带强度增加，表明晶相逐渐出现((图1D)。
矿化过程中收缩应力的产生对应于肌腱沿其纵向收缩。为了揭示矿化过程中肌腱组织的结构变化，本文进行了原位同步加速器SAXS测量（图2A）。矿化过程中对肌腱施加恒定的0.06 N的力，并记录运动位置以评估组织应变。在用SrCO3溶液代替水后，游离离子迅速扩散到纤维间基质中，导致肌腱轻微扩张。随后，组织应变在1.1小时后可观察到快速下降至−0.44%，并在矿化9小时后缓慢收缩至−1.7%。胶原原纤维中的原分子轴向错动导致高分子密度和低分子密度条纹交替出现，这不仅可以通过透射电镜(TEM)观察到，也可以通过SAXS测量。原始肌腱在水中的SAXS模式表现出一系列Bragg峰。第n阶(n = 1,3,5)的q位对应于qn= 2πn/D，其中D为根据间隙和重叠区在胶原原纤维内的周期性间隔(~67 nm)。D间距的纳米变化(与q成反比)是评价矿化过程中肌腱微观应力产生的理想方法。由于相对于一阶散射峰，相对较强的三阶散射峰对D间距的变化更为敏感，因此采用高斯拟合确定峰位。进一步评估跨肌腱样品不同区域的矿化程度和过程中D间距的变化，后者的测量与胶原原纤维的内部、微观应变(原纤维应变)有关，而机械设置产生组织的宏观应变。
图2. 同步辐射小角X散射原位分析胶原在矿化过程中周期性结构的变化
图2B显示了从1分钟到8小时的梯形盒内的反射强度监测的SAXS模式。在某些区域，整体SAXS强度随矿物含量的增加而增加，但不区分结晶性和非晶性。在其他区，没有矿化发生，SAXS的强度仍然很低(图2C)。矿化区与非矿化区存在明显差异。根据胶原原纤维中D间距的时间演化和矿化过程中计算出矿化区和非矿化区均表现出D间距的减小。然而，矿化区域的纤维应变比未矿化区域的纤维应变下降更快。在矿化的区域，SAXS强度(监测矿物的数量)在前2小时急剧增加，只有局部收缩纤维应变的轻微增加。在这之后，矿物质含量继续缓慢增加，伴随着纤维的强烈收缩(接近2%的收缩)。在没有矿化的区域(蓝色符号)，只有最小的收缩。虽然局部应变与纤维内矿物含量之间存在一定的相关性，但这种相关性并不完美，因为矿化引起的应变明显通过弹性相互作用延伸到更大的区域。如图2E所示。最后，宏观收缩并不随时间线性增加。第一个小时速度较快，然后近似线性变化。
图3胶原纤维内无机材料合成产生收缩应力的普适性。
为了查明胶原的收缩是否也导致嵌入纤维中的SrCO3矿物颗粒的压缩，本文使用同步加速器广角X射线散射来提取2D WAXS图案(图3A)。为了确定晶格的潜在压缩或膨胀，本文将(110)、(002)和(200)环的位置与参考样品的峰值位置进行了比较，该参考样品是通过对SrCO3矿化的肌腱进行热处理来诱导晶格中的任何应变通过有机基质的热降解而松弛获得的。在矿化肌腱中，WAXS测量显示晶体沿<200>方向发生明显压缩，但在垂直<002>方向上伸长（图3B）。在<200>晶格方向上测得的压缩应变分别为垂直和水平方向的−0.033%和−0.063%。在垂直<002>方向上，沿垂直和水平方向的膨胀分别为0.049%和0.056%。在测量结束时，还用透射电子显微镜分析了胶原纤维的形态和晶体取向。矿化的胶原纤维的典型例子如图3C所示，矿物基质由细小的SrCO3纳米晶组成，这些纳米晶很好地凝聚在一起，形成了近乎单晶的基质。这一点在选区电子衍射(SAED)中表现得尤为明显。
测试方法：串联PDH-SHC反应
肌腱切片用纯水彻底清洗以去除树脂，然后小心地转移到机械测试装置的样品支架上(图S1)。肌腱切片的两端用夹子固定，其中一个夹子附着在高精度线性工作台上，另一个夹子连接到一个最大容量为20 N的测压元件上。切片沿舞台和测压元件之间的中心轴线对齐。两个夹子之间的自由试样长度约为8 mm。将纯水注入一个腔室，直到肌腱片完全浸没。为了补偿轻微的样品弯曲，在线性阶段的帮助下，肌腱切片被轻微拉伸，以便肌腱切片可以沿着中心轴对齐，直到施加大约0.02 N的预载荷。肌腱切片在水中浸泡12 h后，用150 mM NaCl盐水溶液再浸泡12 h，最后用SrCO3矿化溶液(pH=9.0)代替盐水溶液。随后肌腱矿化引起的力变化被记录下来，直到力平衡并达到一个稳定的平台。矿化液每10-14小时交换一次。首先，新鲜溶液维持了前驱体的活性，促进了肌腱基质连续稳定的矿化;第二，水从开腔室蒸发，导致液体表面减少。在对照组SrCO3溶液(不含PAA)中进行约24小时肌腱的力变化，以1 s为对数间隔测量力的变化。收缩应力的计算除以测得的力的横截面面积的各自的腱片。肌腱切片厚度为100 μm。用安装在立体显微镜(Olympus SZX7)上的数码相机(Basler acA1920-40um)拍摄图像，然后用斐济软件进行图像分析，测量宽度。用数码相机记录矿化过程中肌腱切片形态的演变，每10分钟拍摄一张。
评价：这项工作表明，以前在骨中观察到的羟基磷灰石的沉淀和胶原收缩之间的化学机械耦合效应广泛存在于矿物中。将胶原纤维的应力转移到了嵌入的矿物上，它的晶格在20-40兆帕范围内被强烈压缩，应力方向平行于纤维。这一现象不仅揭示了胶原蛋白的特性，还为通过类似于由钢材施加预应力的混凝土的内应力来提高混合材料的力学性能提供了一个新颖的概念。本文首次实现氟化钙纳米晶体在胶原纤维内的周期性有序合成与结晶，揭示了其结构形成机制。证实前驱体先从空缺区域进入胶原，然后扩散进入重叠区域，而不是传统观点认为的前驱体渗入胶原后直接沿纤维长轴扩散的过程。首次实现了胶原纤维内限域合成碳酸锶压电功能材料。这些研究工作不仅对揭示骨骼形成过程有生物学借鉴意义，对多功能复合材料的合成与制备也有指导意义。
参考文献：
Huang Ping et al. Mineralization generates megapascalcontractile stresses in collagen fibrils. Science, 2022, 376, 188-192.
DOI: 10.1126/science.abm2664
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abm2664
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