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天然的抗氧化活性物质主要包括黄酮类、多酚类、维生素类和多糖等，真菌产生的抗氧化活性物质则主要有醌类、酚类、多糖类、三萜类、对联三苯类等。苯醌是结构最简单的醌类化合物，广泛存在于生物体内，主要包括对苯醌和邻苯醌两大类，而天然存在的苯醌化合物多为对苯醌及其衍生物。苯醌由于其特殊的分子结构，可以参与生物系统中电子和质子的转移过程，具有作为抗氧化剂的潜力。
Xu Qiao等最先从瓶生顶孢霉（Acremonium cavaraeanum）CA022菌株固体发酵中提取分离和鉴定出双对苯醌（DTXT）（图1），这是一种新的苯醌化合物，因而，其生物活性尚未被研究和揭示，并且前期发酵研究获得的DTXT产量也比较低，都将限制其未来可能的应用。南京师范大学生命科学学院的胡彦丽、潘利利、陈双林*等借鉴已知苯醌类化合物具有抗氧化活性的线索，首先探索瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵所产生的DTXT的抗氧化活性。在证明DTXT具有良好抗氧化活性的基础上，通过单因素试验和响应面试验优化固体发酵条件提高其产量。
1、DTXT的提取和纯化
将获得含目标产物的晶体通过HPLC检测，得到检测图谱（图2）。在相同的检测条件下，待测样品中主要物质的出峰时间为6.538 min（图2A），与本实验室保存的纯化对照品出峰时间6.556 min（图2B）基本一致，并且待测样品的纯度达到98%，纯度较高，可以为后续实验使用。
2、DTXT体外抗氧化活性
DTXT还原力
还原力反映了抗氧化物质的总抗氧化能力。DTXT还原力随着质量浓度的提高而增强（表2），当DTXT质量浓度为200 µg/mL时，吸光度为0.608±0.002。在150～200 µg/mL质量浓度范围内，DTXT吸光度较大，与芦丁相当，差异不显著。在20～200 µg/mL范围内，DTXT还原力均显著低于相同质量浓度下的VC，但显著高于相同质量浓度的VE和BHT。结果表明DTXT具有良好的总抗氧化能力。
DTXT对超氧阴离子自由基的清除作用
不同质量浓度的DTXT均能清除超氧阴离子自由基，在20～200 µg/mL范围内，清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强（表3），IC50为112.70 μg/mL。在200 µg/mL质量浓度下，DTXT对超氧阴离子自由基清除率达到（67.00±5.05）%。在150 µg/mL和200 µg/mL质量浓度下，DTXT对超氧阴离子自由基清除率显著高于BHT。在20～200 µg/mL范围内，DTXT清除超氧阴离子自由基的能力与VE大体相当，但低于相同质量浓度的VC和芦丁，且差异显著。
DTXT对羟自由基的清除作用
DTXT对羟自由基具有良好的清除作用，清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强（表4），IC50为78.63 μg/mL。在200 µg/mL时，DTXT对羟自由基清除率为（78.83±3.19）%。在20～200 µg/mL范围内，DTXT对羟自由基清除率均显著高于相同质量浓度的VE和BHT，但低于相同质量浓度的VC。在高质量浓度（150～200 µg/mL）时，与芦丁的清除作用差异不显著。
DTXT对DPPH自由基的清除作用
DTXT对DPPH自由基也具有良好的清除作用（表5），清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强，IC50为88.36 μg/mL。在质量浓度为200 µg/mL时，对DPPH自由基清除率达到（76.53±3.08）%。在较高质量浓度（150 µg/mL和200 µg/mL）下，DTXT对DPPH自由基清除率显著高于相同质量浓度的BHT和VE，低于相同浓度的芦丁，但无显著差异。在20～200 µg/mL范围内，DTXT对DPPH自由基清除率均显著低于相同质量浓度的VC。
3、DTXT的固体发酵
DTXT产量曲线
DTXT产量随着供试菌株瓶生顶孢霉CA022固体发酵培养时间的延长不断增加（图3），在固体发酵14 d达到最大（2 815.89 mg/kg），之后，产量逐步下降，因此将DTXT的固体发酵时间确定为14 d。
碳源对固体发酵产DTXT产量的影响
向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种供试碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖和可溶性淀粉），图4结果表明，它们均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT产量。随着碳源质量分数的增加，DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加，在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT产量达到最高时的各碳源处理质量分数不同，葡萄糖质量分数为1.0%时，DTXT产量达到2 864.83 mg/kg；蔗糖质量分数为1.25%时，DTXT产量达到1 564.15 mg/kg；麦芽糖质量分数为1.25%时，DTXT产量达到 2 693.61 mg/kg；果糖质量分数为1.25%时，DTXT产量达到2 024.51 mg/kg；乳糖质量分数为1.25%时，DTXT产量达到2 210.11 mg/kg；可溶性淀粉质量分数为1.0%时，DTXT产量达到2 349.49 mg/kg。相比于另外5 种碳源，葡萄糖在较低质量分数时，DTXT产量就达到最高，且高于其他5 种碳源处理的最高产量。
氮源对固体发酵产DTXT产量的影响
向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种供试氮源（硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、尿素和蛋白胨），图5结果表明，它们均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT产量。随着氮源质量分数的增加，DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加，在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT产量达到最高时的各氮源处理质量分数不同，硝酸钠质量分数为0.175%时，DTXT产量达到2 837.97 mg/kg；硝酸钾质量分数为0.175%时，DTXT产量达到2 444.31 mg/kg；氯化铵质量分数为0.175%时，DTXT产量达到992.47 mg/kg；硫酸铵质量分数为0.15%时，DTXT产量达到864.27 mg/kg；尿素质量分数为0.15%时，DTXT产量达到700.06 mg/kg；蛋白胨质量分数为0.175%时，DTXT产量达到643.24 mg/kg。相比于另外5 种氮源，添加0.175%硝酸钠时，DTXT产量最高，且显著高于其他5 种氮源处理的最高产量（P＜0.05）。
微量元素对固体发酵产DTXT产量的影响
向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加5 种微量元素（MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·7H2O和H3BO3），图6结果表明，它们均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT产量。随着微量元素质量分数的升高，DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加，在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT达到最高时的各微量元素处理质量分数不同，MgSO4质量分数为0.03%时，DTXT产量达到2 558.55 mg/kg；ZnSO4质量分数为0.03%时，DTXT产量达到1 452.88 mg/kg；FeSO4质量分数为0.025%时，DTXT产量达到572.50 mg/kg；MnSO4质量分数为0.025%时，DTXT产量达到727.36 mg/kg；H3BO3质量分数为0.03%时，DTXT产量达到2 831.37 mg/kg。相比于另外5 种微量元素，H3BO3效果最佳，质量分数为0.03%时，DTXT产量最高，且显著高于其他4 种供试微量元素处理的最高产量（P＜0.05）。
维生素对固体发酵产DTXT产量的影响
向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种B族维生素——硫胺素（VB1）、核黄素（VB2）、烟酸（VB3）、吡哆素（VB6）、生物素（VB7）和钴胺素（VB12），结果表明（图7），与不添加任何维生素的处理相比，它们在一定程度上均可提高固体发酵DTXT产量，但差异不显著。其中VB1的效果最好，含量为75 μg/100 g时，DTXT产量最高，达到4 254.90 mg/kg。
响应面试验结果
根据单因素试验结果，分别选择葡萄糖、硝酸钠、H3BO3和VB1作为瓶生顶孢霉CA022菌株固态发酵产DTXT的组合处理，利用Design-Expert 12.0进行中心组合试验设计，共30 组，所得结果如表6所示。
由回归模型方差分析（表7）可以看出，响应模型的P＜0.000 1，F=75.65，失拟项P=0.228 6＞0.05不显著，表明该模型拟合度较高。此外，模型的相关系数R2为0.986 0，说明该模型可以解释98.60%的响应值变化，只有很小的变量（1.40%）没有得到合理的解释，表明预测结果与实际结果的一致性较好。
由图8可以看出，各因素交互作用大小依次为：葡萄糖与H3BO3＞硝酸钠与VB1＞葡萄糖与硝酸钠＞硝酸钠与H3BO3＞葡萄糖与VB1＞H3BO3与VB1，与表7回归分析结果相符。
通过Design-Expert 12.0软件，预测得到瓶生顶孢霉CA022菌株发酵产DTXT的最优组合为葡萄糖0.773%、硝酸钠0.185%、H3BO3 0.032%、VB1 100 μg/100 g，预测得到的DTXT最大产量为4 016.24 mg/kg。在模型预测最优组合条件下进行发酵，实际得到的DTXT产量为4 150.80 mg/kg。实验值与理论值在合理的误差范围内，证明该优化方案可行，可用于DTXT的生产。
结 论
通过体外抗氧化实验考察了DTXT的抗氧化活性，通过优化瓶生顶孢霉CA022菌株的培养基配方，提高了DTXT产量。体外抗氧化实验结果表明，DTXT还原能力以及对DPPH自由基和羟自由基的清除能力与芦丁大体相当，具有作为抗氧化剂的潜力。响应面试验结果表明，优化后的DTXT产量（4 150.80 mg/kg）是优化前（2 864.83 mg/kg）的1.45 倍，为DTXT固体发酵的研发提供了理论依据。
本文《双对苯醌的抗氧化活性分析及其固体发酵条件优化》来源于《食品科学》2022年43卷14期199-207页，作者：胡彦丽，潘利利，闫淑珍，陈双林。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210724-289。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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