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导读
近日，9月23日，西北农林科技大学生命学院刘坤祥教授领衔的植物氮素营养团队的研究成果《NLP7转录因子是植物的一个硝酸盐受体》在《科学》在线发表。这是西北农林科技大学继7月份在《细胞》发表重要研究之后的又一重大成果。
西北农林科技大学生命学院刘坤祥教授，博士生刘孟红、林子炜，哈佛大学Zi-Fu Wang，师资博士后陈斌卿为共同一作，哈佛大学医学院Jen Sheen教授，生命学院刘坤祥教授为通讯作者。西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室、生命学院为第一署名单位，未来农业研究院为第二单位，哈佛医学院为第三单位。此外，哈佛大学医学院布拉瓦特尼克研究所、东京大学农业生物技术研究中心的研究者也参与了本项研究。
氮元素是构成生物体最基本元素之一。农业生产中，硝态氮是增加农作物产量的重要因素。植物可以感受到不同浓度的硝态氮，并迅速发生转录水平、代谢水平、激素信号、根系及地上部分的协调生长和生殖生长等方面的变化，从而调控自身的代谢和生长反应。因此，硝态氮不仅是植物必需的矿质营养盐，也是重要的信号分子。
20世纪90年代，科学家已经可以在基因水平确定硝态氮是一种信号分子，但并不清楚植物感受它的机制。2009年，有科学家发表文章认为CHL1/NRT1.1蛋白除了硝酸盐转运的功能以外，还存在感受硝态氮的功能。随后的十多年，很多研究者都认为CHL1/NRT1.1是硝酸盐的感受器。但刘坤祥根据多年研究认为，CHL1/NRT1.1蛋白不是一个主要的硝酸盐感受器。
在此前研究的基础上，刘坤祥发现了新的植物硝酸盐信号“开关”——NLP7蛋白。2018年，他带领团队和时间赛跑，夜以继日地用科学实验来实证，在今年8月份取得了重大成果，确定NLP7蛋白代表了陆生植物的一种硝酸盐受体。研究表明，NLP家族的NLP2/4/5/6/7/8/9作为转录因子起始了硝酸盐诱导的转录重塑和物质运输、代谢、激素信号转导和根系及地上部分的生长等发育进程。通过新型的分子互作检测方法证实了硝酸盐可以和NLP7蛋白直接互作。设计实验将黄色荧光蛋白—柠檬黄切成两半分别接在NLP7蛋白的两端，可以构成一个荧光硝酸盐感受器，借助它可以用肉眼实现对植物细胞水平的硝酸盐动态观察分析。
该研究的创新点在于：一是发现了NLP7蛋白除了是硝态氮信号途径的转录因子，还具有硝酸盐受体的作用，这不同于以往在细胞膜上发现的硝酸盐受体；二是开发了荧光硝酸盐感受器，方便在细胞水平观察到植物体内硝酸盐的含量和变化。该研究结果的重大意义在于阐明了光合自养植物通过感受硝态氮进而激活植物信号转导网络和生长反应的调节机制，这一发现将为提高作物的氮利用效率，减少化肥使用和能源消耗，减轻由温室气体排放引起的气候变化，进而为支持农业的可持续发展提供新的启迪。
刘坤祥团队《科学》的故事：NLP7——众里寻“他”千百度
“众里寻他千百度，蓦然回首，那人却在灯火阑珊处。”对我校生命学院刘坤祥教授来说，苦苦寻找了20年的“他”——植物硝酸盐受体NLP7，在其带领的植物氮素营养团队四年夜以继日的实验中，得到了证实。
这一结果9月23日于《科学》在线发表，代表我校布局在植物营养领域方向的研究取得了重大突破。“这个发现为提高作物的氮利用效率，减少化肥使用和能源消耗，减轻由温室气体排放引起的气候变化，进而支持农业的可持续发展提供了新的启迪。”
生命学院刘坤祥教授
梦想：众里寻“他”二十年
“我大胆设想植物内是否存在一个类似荷尔蒙的感受蛋白，可以感受到硝态氮的存在，进行下游信号转导。找到一个硝酸盐感受器一直是我的梦想。”
刘坤祥教授本硕就读于台湾大学，2003年博士毕业于台湾国防医学院，随即前往美国哈佛医学院麻省总医院，在Jen Sheen实验室做博士后。在此前硝态氮吸收转运研究的基础上，他萌生研究植物感受硝态氮机制的梦想。
从此开始一直寻找植物是如何感受硝态氮，有哪些蛋白分子可以参与植物感受硝态氮的存在，进而诱导下游基因表达和影响植物生长。“研究植物如何有效地获取氮，除了对植物是很重要的，同时它也是生物圈内如何从无机氮变成有机氮的重要步骤。没想到这一找竟然花了20年的时间。”
氮元素是构成生物体最基本元素之一。生物体没有氮就无法生存。农业生产中，硝态氮是增加农作物产量的重要因素。在1980年左右，人们就认为硝态氮是植物养分和氮的来源；20世纪九十年代，人们发现植物存在感受硝态氮的能力，并且在基因表达水平上检测到硝态氮不仅是一种营养元素，也可以作为一种信号分子。
虽然之后有很多研究都认为硝态氮是一种信号分子，但当时不清楚植物是如何感受它的。2009年，刘坤祥曾经所在的台湾实验室发表文章认为CHL1/NRT1.1蛋白除了膜转运蛋白的功能以外，还存在感受硝态氮的功能，影响后面一些基因的表达。
十多年来，很多研究者都认为CHL1/NRT1.1是硝酸盐的感受器。但刘坤祥根据多年的研究，认为它不是一个主要的硝酸盐感受器。他一直怀疑除了CHL1/NRT1.1以外，植物应该还存在其它感受硝态氮的感受器。为了梦想，他一直在文献与实验中苦苦探寻。
2008年，有研究者在拟南芥中发现豆科植物NIN蛋白的同源蛋白-NLP7，它的突变体可以影响植物对氮的响应，但对它并没有进行更深入的研究。之后有很多研究表明NLP作为一个重要的转录因子参与了氮信号通路。
2017年，刘坤祥发现一类钙离子依赖的激酶CPK可以感受到外界硝态氮的刺激，影响钙离子浓度变化，进而影响CPK的活性。同时也发现，CPK可以通过直接磷酸化NLP调控硝态氮诱导的下游基因表达。
因为找到了Nitrate-Ca2+-CPK-NLP7的连接，而且前期也实验发现：在没有硝态氮的情况下，大量表达NLP7或者CPK，并不会诱导下游基因的表达。因此，他极度怀疑NLP7可能可以直接感受硝态氮的存在。“NLP7蛋白感受硝态氮存在两个可能，首先是NLP7蛋白直接结合硝态氮，其次是有一个所谓的硝酸盐受体可以感受到硝态氮，然后结构发生改变或者有某个蛋白和它结合，然后再去调节NLP7的活性。”
大多数研究者认为NLP7可能需要跟别的蛋白结合，那个蛋白才是真正的硝酸盐受体。但刘坤祥始终怀疑NLP7有没有可能直接结合硝酸盐，并为此不懈努力着。努力的结果证明他的怀疑是正确的，从设想到怀疑到发现到证明，梦想的实现用了他宝贵的二十年。
发现：“缘”来是“他”蓦然间
如何证明NLP7可以直接结合硝酸盐？这个问题一直萦绕在刘坤祥的脑海间。
一次偶然的机会，他认识了美国实验室的一位同事。恰巧那位同事当时正在用微量热泳动仪(MST)做研究，因此，刘坤祥就托他帮忙用MST去检测硝酸盐是否会结合NLP7。
由于缺乏经验，第一次实验他们没有发现两者的互作。但幸运的是，旁边一位专门做癌症药物筛选的专家Wang zifu听到了他们的对话，发现了实验中的不足，提供了一些技术上的改进方案，并用仪器证实硝酸盐会和NLP7结合。
“我非常兴奋，因为这证明了我的设想。因为有这样的发现，我在西农的故事拉开了序幕。”刘坤祥教授2018年由副校长马建华和时任生命学院的院长郁飞教授引进，并给予了他大力支持。
来到学校后，刘坤祥教授迅速组建了植物氮素营养团队，全身心投入到NLP7就是一种新的硝酸盐受体的研究中。目前，他的团队有博士生7人，硕士生7人，科研助理1人，师资博士后1人。
植物氮素营养团队
科学是高尚的，它的本质就是求真。科研的目标是不断拓展人类知识的边界、推动技术进步。但激烈的同行竞争，有时会使科研显得有些残酷。
日本东京大学有一个研究组也在进行相关的研究，刘坤祥团队就和时间赛跑。因为疫情，他被困在了美国，不能回到国内面对面指导。在美国开展实验的同时，晚上给团队开组会、谈实验经常到凌晨。匆匆休息四五个小时，又要赶着上早上的本科生网课。
经费短缺是团队面临的另一个困境。从项目保密的角度出发，他们没有用NLP7的课题申请国家基金，而做这个研究又非常花钱，但在生命学院的大力支持下，他们的研究进展得很顺利。“非常感谢学院前院长郁飞教授、现院长马闯教授，他们想尽办法在研究器材、研究经费方面提供大力支持，帮助我们实验室渡过难关。”
实验室初创的时候，需要一台能够测量到很小株型植物中硝酸盐含量的机器。在生命学院党委书记刘卫军的推进下，从食品学院农业部食品测试中心找到一台离子色谱仪。“在本研究中，由这台机器测定出的结果也用到了文章中，尽管图片不大，但它也是一个非常重要的研究结果。”
为了增加这项研究的可信度，不少在植物营养研究中不常用到的新技术被应用于此，比如，在动物细胞测试蛋白结合硝酸盐激活基因表达的实验、表面等离子体共振等实验。这些实验因为在植物营养研究中应用的还很少，所以要做大量的设计和测试。但他们通过巨大的工作量，取得了这些方面的成功。
实证：果然是“他”功未央
“这不是一个人的成功，这是一个团队的成功。”刘坤祥教授非常赞赏他的团队，“他们专注科研，专心实验，取得了‘1+1>2’的效果，这是我的幸运。”
每一个团队的成功，都写满了每个成员的努力。
2020级博士生刘孟红，主要负责在植物中寻找NLP7蛋白结合硝酸盐的氨基酸残基，并筛选到了几个关键的点突变，然后将它们转回到NLP7的突变体植物，验证和证明了这些位点是结合硝酸盐的重要位点。
刘孟红在做实验
可为了早日完成这个项目，通宵达旦做实验成了她的家常便饭。因担心被疫情隔离影响实验进度，两年多都没有回家。妈妈在了解到她的生活状态后感慨道：“你们的生活真不是常人过的。”
2019级博士生林子炜，硕士期间就是刘坤祥教授的学生，被刘老师的科研水平和人格魅力所吸引，不顾家人的反对，从南方跑到北方继续攻读刘老师的博士。
林子炜在做实验
在这个项目里，他主要负责细胞生物学实验—显微镜下的拍摄工作。从2020年6月开始，他每个星期里都会在大型仪器实验平台呆三到四次，每次一坐就是三四个小时。终于，取得了在显微镜下可用肉眼观察硝酸盐受体与硝酸盐结合的证据。
2020级博士生刘聪，2020级硕士生郭阿萍，他们都参与了其中的工作。快乐，专注，团结，友爱，就是这个团队的真实写照。“实验不烦恼，脱发很苦恼！”林子炜的幽默，引得大家频频点头并发出欢乐的笑声。
陈斌卿在做实验
师资博士后陈斌卿，通过大量的设计和测试，利用动物细胞重新展示了NLP7能够结合硝酸盐，然后诱导下游基因的表达。“因为动物细胞没有硝酸盐感受系统，这也是本研究中的另外一个证据。”
实验过程中，他还和林子炜开发了一个荧光硝酸盐感受器。用这个硝酸盐感受器可以借助显微镜，用肉眼看到对植物施加硝酸盐后，因荧光硝酸盐感受器结合硝酸盐发出的荧光，可以看到植物NLP7蛋白真的可以结合硝酸盐。
刘坤祥教授介绍，可以通过改良这个硝酸盐感受器，来探究植物是何时、在什么组织、器官感受硝酸盐以及硝酸盐是如何传输的，在未来可以为植物生理方面的研究提供一个重要工具。
团队四年多的努力，证实了刘坤祥的设想，实现了他二十年的梦想——找到了硝酸盐的感受器。同时，这个NLP蛋白是一个很特殊的例子，直接就是一个感受器，它可以感受到无机营养盐的存在，可以结合硝酸盐，去调控它的活性，这是一个全新的发现。
刘坤祥团队的研究结果，阐明了光合自养植物通过感受无机氮进而激活植物信号转导网络和生长反应的调节机制。他计划将在模式植物中发现的植物氮素营养规律尽早应用到农作物或园艺植物育种上，为培育高肥料利用效率新品种服务，以减少氮肥消耗，助力国家绿色农业发展和低碳经济发展。“我们手上还有非常多正在进行中的研究项目，我相信也将是一些非常重大的发现！”
来源：西北农林科技大学
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