吉林农业大学考研(吉林农业大学考研专业目录)
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黑木耳（Auricularia auricula）是我国重要的药食同源真菌，其中多糖为其主要的活性成分，高达70%以上。相关研究表明黑木耳多糖具有抗氧化、抗癌、提高免疫等多种功能活性，其生物活性取决于它们的结构特征，包括单糖组成、糖苷键类型、分支结构和构象特征等。目前相比于多糖的物理修饰，化学修饰（例如硫酸盐修饰、磷酸盐修饰、羧甲基修饰等）更能提高其生物活性。
相关研究表明，食用菌多糖是治疗糖尿病的有效途径。但有关磷酸化修饰多糖降血糖活性研究却鲜有报道。因此，吉林农业大学食品科学与工程学院的陈玥彤、张闪闪、刘婷婷*等以黑木耳多糖为原料进行磷酸化修饰，并对其结构及体外降血糖活性进行表征与评价，以期为黑木耳高值化利用和新型功能性食品的开发提供参考。
1、磷酸化多糖的理化性质及结构特征
01
黑木耳多糖磷酸根含量的测定结果
黑木耳多糖中磷酸根含量作为磷酸化修饰程度的评价指标，其生物活性取决于磷酸根含量的多少。由表1可以看出，磷酸根含量随反应温度的升高逐渐递增，在90 ℃时磷酸根质量分数为8.49%。这是因为能量的升高会使高分子键的活性增强，磷酸化试剂的利用率也会随之增加。
02
相对分子质量测定结果
由表2可以看出，PAAP的相对分子质量明显低于AAP。低分子质量多糖通过抑制肠道内碳水化合物的降解对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶产生抑制作用，这也为修饰后黑木耳多糖降血糖活性升高提供理论依据。随温度升高磷酸化黑木耳多糖相对分子质量明显降低，其多糖分散指数接近1，说明AAP及PAAP的平均相对分子质量分布集中，纯度较高。
03
磷酸化多糖的单糖组成
如图1所示，利用高效液相色谱分析，与标准单糖衍生后的保留时间进行对比，AAP主要是由Rib、Fuc、Xyl、Fru、Man、Gal、Glu组成的杂多糖，其构成单糖基的物质的量比为0.6∶0.41∶1.1∶1.18∶19.72∶0.74∶18.09。PAAP-（1～4）主要由Fuc、Xyl、Fru、Man、Gal、Glu组成的杂多糖，虽其相互间具有相似的单糖组成，但构成单糖基的物质的量比有所差异。
04
紫外光谱分析
图2显示AAP及PAAP-（1～4）在260 nm和280 nm波长处均无明显的吸收峰，因此可以说明黑木耳多糖及磷酸化修饰多糖核酸和蛋白质含量较低。黑木耳多糖经修饰后形成了化学键束缚，从而导致紫外吸收强度有所减弱，其峰值明显降低。
05
刚果红实验
如图3可知，AAP与刚果红对照组相比无明显差异，但多糖经磷酸化修饰后，磷酸根发生了取代反应在低NaOH浓度下最大吸收波长极具增加，说明其发生了分子间作用力变化，具有三股螺旋结构。因此可以猜测，磷酸化黑木耳多糖与β-1,3-糖苷键形成三螺旋构象时可提高多糖的生物活性，为后续体外降糖研究提供结构基础。
06
红外光谱分析
如图4可以看出，AAP及PAAP吸收峰为典型的多糖吸收峰，黑木耳多糖修饰前后主体结构没有发生改变。在3 336 cm-1处吸收峰主要是由OüH所引起，磷酸化修饰后吸收峰明显增强，这是由于修饰后的氢键和主链长度被破坏，暴露出更多的氢键和烷基键。取代的磷酸根带有2个—OH，增加了修饰后多糖的—OH个数，从而增加了其水溶性，使其具有更强的活性。
07
扫描电镜分析
由图5所示，AAP的主要形态为表面均匀的致密片层结构，碎片大且平整光滑，无卷曲，部分出现堆积现象。这说明AAP的分子质量偏大，形态均一，分子间作用力大。PAAP-（1～4）的扫描电镜图与AAP相比呈细小碎片状，随温度的升高磷酸化多糖呈现蜷曲状，说明其分子间作用力降低，氢键作用力减小与红外推测相吻合。同时与党参多糖修饰前表面光滑，有不规则和交错的条纹，而修饰后表面粗糙不平，且有很多凸起的球体结果相似。
08
核磁共振分析
PAAP-4的磷酸根含量较高，因此选取PAAP-4进行核磁测定。因磷酸盐为弱电子吸收基团，磷酸化衍生物的 13 C核磁共振与非衍生多糖相似。由图6可以看出，AAP的C3、C5、C2、C4在δ 69～76处，δ 60.46为C6的化学位移，经磷酸化修饰后，C6的化学位移向低场移动至δ 69.27，这与碳信号附着在吸电子的磷酸基上时，会向低场移动结果一致。由此表明磷酸化修饰在C6位置上发生了取代反应。
利用 31 P核磁共振进行谱图分析，如图7所示，相比AAP，PAAP在δ 0.94、-8.19处出现新的信号峰，说明多糖中有2个不同位置的羟基被磷酸基取代，进一步验证磷酸化修饰成功。
2、磷酸化多糖体外降血糖活性
01
α-淀粉酶抑制率
由图8可知，在质量浓度为5 mg/mL时，PAAP-4和AAP的抑制率分别为41.08%和31.47%，PAAP-4较AAP的抑制率提高了10.03%，二者的IC50分别为5.835、3.038 mg/mL，可知同条件下，PAAP-4对α-淀粉酶的抑制能力达AAP样液的1.92 倍。可有效通过抑制α-淀粉酶活性从而抑制高聚糖的分解，达到降血糖目的。
02
α-葡萄糖苷酶抑制率
由图9可知，随着AAP及PAAP-（1～4）质量浓度的升高，α-葡萄糖苷酶的抑制率也随之增加。质量浓度为5 mg/mL时，PAAP-4和AAP的抑制率分别为56.89%和47.88%，PAAP-4较AAP的抑制率提高了9.01%，二者的IC 50 分别为27.22、10.66 mg/mL，可知同条件下，PAAP-4对α-葡萄糖苷酶的抑制能力达到AAP样液的2.55 倍。
结果表明
磷酸化黑木耳多糖主要由木糖、果糖、甘露糖以及葡萄糖组成的杂多糖，随着温度的升高磷酸化黑木耳多糖相对分子质量明显下降，并出现三股螺旋结构。红外图谱显示在1 205、898 cm－1处出现了P＝O及P—O—C的特征吸收峰。核磁共振光谱分析表明磷酸化修饰主要发生在C6位的羟基上，且在δ 0～1.5范围内出现了磷酸基团中P的信号峰。扫描电镜结果表明修饰后黑木耳多糖表面形貌变化明显，相比修饰前多糖更加细小、破碎。且对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有较强的抑制作用，当PAAP-4质量浓度为5.0 mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制率为56.89%，体外降血糖活性增强。
本文《黑木耳多糖的磷酸化修饰、结构表征及体外降糖活性》来源于《食品科学》2022年43卷7期29-35页，作者：陈玥彤，张闪闪，李文意，于文浩，赵晓芳，刘婷婷。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210908-091。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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