中国农业科学院草原研究所，中国农业科学院草原研究所怎么样
白藜芦醇（Res）又称芪三酚，是一种存在于虎杖、花生、葡萄等植物中的非黄酮类多酚化合物，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用，但存在熔点高、脂溶性差、靶点多、生物利用度低等问题，限制了其在食品领域的应用。为了解决以上问题，Res酯化改性近年来备受关注。
中国农业科学院农产品加工研究所的胡小宁、王 强*和山东农业大学食品科学与工程学院的唐晓珍*等重点综述了国内外Res酯的性质、Res酯化改性方法、分离纯化技术及表征方法的研究现状和最新进展，以期为Res酯的定向合成及应用提供方法和技术支撑。
1、Res酯的性质与作用
Res性质
Res化学名称为3,4’,5-三羟基二苯乙烯，分子式为C14H12O3，相对分子质量为228.25。常温下为白色针状晶体，难溶于水和油，见光易分解，易溶于多数有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、氯仿等）。在自然界中以顺式、反式Res和顺式、反式Res苷4 种形式存在，现有研究已证明Res在植物中主要以反式构象存在，反式Res的活性远高于顺式Res，且反式Res中4’-OH的活性＞3-OH的活性＞5-OH的活性，4’-OH为主要活性位点，由于4’-OH的键长最长，容易断裂，反应活性最好。
Res酯的性质
Res的3 个羟基在一定条件下与羧酸、酰氯或酸酐等发生酯化反应生成单酯、二酯和三酯（图1），根据不同的原料比例和反应条件会生成不同的酯化产物。经过酯化的Res难溶于水，但其脂溶性大大提高，并且脂溶性随着脂肪酸链的延长而增加，随着脂肪酸不饱和度的增加而降低。目前，酯化改性的Res主要是Res三酯，如Res芳香酯、Res长链脂肪酸酯、Res中链脂肪酸酯及Res短链脂肪酸酯，其中Res芳香酯比例最大。
Res酯的作用
关于Res的作用已有较多研究报道，且Res被证实具有抗炎、降脂、抗氧化、抗肿瘤和保肝等作用。黄鹏等研究发现Res烟酸酯对10%蛋清诱导大鼠足肿胀和二甲苯诱导大鼠耳肿胀的抑制作用优于Res，并且还可明显降低75%蛋黄液引起的高脂血症模型血清中甘油三酯和血清总胆固醇浓度升高。Res磺酸酯也具有较好的抗氧化作用，能够有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）阳离子自由基，同时还能显著抑制人体肺癌细胞A549生长，起到抗肿瘤作用，且其作用效果优于Res。
2、Res的酯化改性方法
Res含有3 个酚羟基，具有较高的生物活性，但其具有熔点高、脂溶性和水溶性差等特性导致生物利用度低，直接应用到食品中易结晶析出，特别是在Res含量高的体系中，严重影响食品品质。因此，为了增加Res的稳定性和脂溶性，降低熔点，提高其生物利用度，Res的酯化改性越来越受到国内外研究者和企业的高度关注。目前Res的酯化改性方法有化学改性法和酶催化法（表1）。
3、Res酯的纯化方法
硅胶柱层析法
硅胶柱层析法具有绿色环保、操作简单等优点，在Res酯的分离纯化中有很高的应用价值。酯化改性的Res粗产物中常常含有游离的Res、Res单酯、二酯、三酯和过量羧酸，硅胶柱层析法可将其分离，但其分离效率低且耗时长，不适用于工业化生产，而且整个过程还需要薄层色谱法进行辅助检测。其常用的洗脱液为正己烷-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯和正己烷-乙酸乙酯-甲酸等。
不同的Res酯需要的洗脱溶剂类型和体积比不同，其洗脱条件应根据目标产物的性质进行优化，但由于硅胶柱层析法粒径（200～300 目）相比高效液相色谱柱粒径（3～10 μm）大上百倍，有时无法将Res酯的5 种结构完全分离，若要获得单一目标物，需考虑分离效率更高的方法。
制备与半制备型液相色谱法
液相色谱法根据应用方向分为分析型、制备和半制备液相色谱法。制备与半制备液相色谱法相比于其他纯化方法分辨率和成本高，常用于样品纯化的最后阶段。制备与半制备液相色谱由于柱长（前者20～70 cm，后者15～50 cm）、柱内径（前者高于20 mm，后者低于10 mm）和流速不同，两者上样量不同，制备型上样量更大（0.1～100.0 g），但是没有半制备型（＜100 mg）灵敏。在Res酯的纯化中，无论是制备液相色谱法还是半制备液相色谱法常用的色谱柱都为C18。常用的流动相为乙腈-水和甲醇-水。以丙酮-水作为流动相（60∶40或55∶45，V/V）可有效分离Res月桂酸单酯与二酯。
重结晶法
重结晶法是利用结晶过程中不同物质溶解度不同而将混合物分离提纯的方法。当Res酯纯度较高时（杂质质量分数低于5%）宜采用重结晶法。重结晶法操作简单、纯度高、适合工业化生产，结晶溶剂的选择也尤为重要。常用的结晶溶剂有甲醇、石油醚-乙酸乙酯、无水丙酮和氯仿-乙醇，结晶溶剂从毒性极大的氯仿逐步向毒性低的丙酮和甲醇转变。现有研究以氯仿-乙醇作为结晶溶剂，采用重结晶法纯化Res烟酸酯，得到白色固体。最新研究将Res月桂酸酯经硅胶柱层析和半制备液相色谱分离，再以甲醇重结晶制得高纯度的Res烟酸酯，纯度可达99.3%。
4、Res酯的表征方法
薄层色谱法
酯化改性的Res一般包括5 种取代产物，需要经TLC分析，来判断产物类别，监测反应进程。Res含有3 个－OH，极性较大，酯化改性后极性减小，并随着取代基数量的增多而减小（Rf随取代基数量的增多而增加）。目前，常用的展开剂组合有石油醚-乙酸乙酯和正己烷-乙酸乙酯，通常会加入少量甲酸或乙酸防止斑点拖尾，其中最常用的是石油醚-乙酸乙酯。
傅里叶变换红外光谱法
利用FTIR可根据吸收峰来快速判断是否有Res酯生成，扫描范围一般在4 000～600 cm－1。对于Res，在3 500～3 000 cm－1有明显的羟基吸收峰，如果有Res酯生成，其羟基吸收峰强度会明显减小，并且会在1 740 cm－1和1 170 cm－1附近产生明显的酯基（分别为C＝O和C－O）吸收峰，但无法确定具体是Res分子哪个羟基参与酯化反应，如果在3 000 cm－1以上没有强峰，说明Res 3 个羟基都参与反应。利用FTIR只能判断酯化反应是否发生，要想准确判断酯化位置，需借助核磁进一步分析。
核磁共振法
Res的H NMR化学位移在δ 6.1～9.5，C NMR化学位移在δ 100～160。常用的检测溶剂有氚代二甲基亚砜、氚代氯仿（CDCl3）、氚代乙腈（CD3CN）、氚代丙酮和氚代甲醇（CD4O）。仪器兆赫数从之前的400 MHz逐渐升级为600 MHz，大大提高了谱图的分辨率。Res的核磁氢谱从低位移到高位移特征吸收峰依次是4’位、35位、2’6’位、CH＝CH、3’5’位、26位、4位。
高效液相色谱法
利用HPLC可计算Res酯的纯度和酯化率，并且可以判断产物类型。Res极性大，保留时间较短，如果制备单酯、二酯和三酯，保留时间依次延长。现有研究以丙酮-水作为流动相、UV检测器，采用HPLC依据峰数目来判断所制备Res月桂酸酯的类别，分离效果良好。最新报道以乙腈-水作为流动相，采用PDA检测器来检测3 种Res辛酸酯在口腔、胃相和肠道的变化情况，研究了不同消化条件对酯键的影响。HPLC-MS是在液相色谱基础上发展起来的新技术，与HPLC相比选择性更好、灵敏度和准确度更高，既能检测单一成分，又能检测混合物，既能定性，又能定量，其效果明显优于PDA和紫外检测器，最重要的是质谱具有强大的结构鉴定能力，可以根据分子质量将未知峰准确判断出来。
结 语
传统化学法虽然技术成熟、产率高，但存在产物复杂、纯化困难和环境污染等问题；酶法虽然环保、副产物少、能耗较低，但酶价格过高且活性较难保持。由于Res的酚羟基易受芳环影响，亲核性降低，发生酯化反应比醇困难，因此酯化改性工艺亟待在以下3 个方面进行深入的研究：1）寻找绿色高效的催化剂；2）研发低成本且对环境要求低的酶制剂；3）将微波、超声等技术应用于Res的酯化改性。从分离纯化角度看，需进一步探索高速逆流色谱、超临界反溶剂萃取、分子蒸馏等现代分离技术以实现不同结构Res酯的高效纯化。在表征方面应根据不同结构Res酯的性质来选择适合的检测方法，单一的检测方法很难满足深入研究的需要，两种及以上方法的组合、联用是未来研究趋势；超高效液相色谱（UPLC）和UPLC-四极杆-飞行时间质谱等新的结构表征方法由于分离度好、灵敏度高、分析时间短，也可用于Res酯的分析。
本文《白藜芦醇酯化改性及其纯化表征研究进展》来源于《食品科学》2022年43卷5期374-382页，作者：胡小宁，李甜，郭芹，李宁阳，张雨，屈阳，王新萍，唐晓珍，王强。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201201-021。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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